Semax i Selank: budowa, analityka i postępowanie w badaniach

Przegląd: dwie nazwy, dwa heptapeptydy

Semax i Selank to krótkie, liniowe peptydy złożone z siedmiu aminokwasów każdy. Obie nazwy są nazwami zwyczajowymi; jednoznacznie każdą cząsteczkę opisują dopiero sekwencja, wzór sumaryczny i numer CAS. Jak odczytywać oznaczenia:

• ACTH(4-7)-Pro-Gly-Pro: Liczby w nawiasie wskazują pozycje w hormonie wyjściowym, tu pozycje od 4 do 7 hormonu adrenokortykotropowego, po których następuje dołączona sekwencja częściowa.
• H- … -OH: skrócony zapis wolnych końców łańcucha. Poprzedzające „Ac-” oznaczałoby acetylację, a dołączone „-NH2” – amid na końcu karboksylowym.
• Semax + Selank: nazwa katalogowa zestawu dwóch osobnych fiolek; nie jest to ani mieszanina, ani odrębna cząsteczka.

Budowa w szczegółach

Oba łańcuchy składają się z czteroczłonowego odcinka początkowego pochodzenia naturalnego oraz zakończenia Pro-Gly-Pro. Pod względem chemicznym odcinki początkowe różnią się jednak znacznie:

• Semax, H-Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH: Metionina ma wrażliwy na utlenianie tioeter, kwas glutaminowy – grupę karboksylową, histydyna – pierścień imidazolowy, a fenyloalanina – hydrofobową resztę aromatyczną. Przy obojętnym pH cząsteczka ma rachunkowo słaby ładunek ujemny.
• Selank, H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH: Treonina ma grupę hydroksylową, lizyna – pierwszorzędową grupę aminową, a arginina – grupę guanidynową. Wraz z końcem aminowym, lizyną i argininą Selank ma trzy centra zasadowe; przy obojętnym pH jest wyraźnie naładowany dodatnio i bardzo polarny.

Motyw Pro-Gly-Pro kształtuje konformację końca łańcucha: prolina nie ma atomu wodoru przy azocie, a jej pierścień ogranicza swobodę obrotu szkieletu. Wiązania przy prolinie wiele peptydaz rozszczepia tylko powoli; literatura fachowa opisuje więc to zakończenie jako element stabilizujący wobec rozkładu enzymatycznego. Innych modyfikacji brak: nie ma cyklizacji, acetylacji ani amidowania, nie ma cysteiny, a więc i mostka disiarczkowego, nie ma też kompleksu metalu.

Odróżnienie od pokrewnych cząsteczek

• ACTH(4-10): naturalna sekwencja częściowa Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly; z sekwencją Semax zgodne są tylko pierwsze cztery reszty.
• α-MSH: zawiera Met-Glu-His-Phe w pozycjach od 4 do 7, ale jest acetylowany na końcu aminowym i amidowany na końcu karboksylowym.
• MT1 i MT2: analogi α-MSH z norleucyną zamiast metioniny; MT2 jest dodatkowo zamknięty w pierścień mostkiem laktamowym.
• Tuftsyna: Thr-Lys-Pro-Arg, tetrapeptyd o masie 500,6 g/mol, identyczny z pierwszymi czterema resztami sekwencji Selank.
• Warianty acetylowane i amidowane: Niektóre katalogi zawierają formy zmodyfikowane, takie jak „N-Acetyl Semax Amidate”. Acetylacja (+42,01 Da) i amidowanie (−0,98 Da) przesuwają łącznie masę monoizotopową o około 41 Da. Peptydy oferowane przez GPeptides mają wolne końce; spektrometria mas jednoznacznie rozróżnia obie formy.

Na co zwrócić uwagę w analityce i COA

Przy sprawdzaniu tożsamości liczą się masy monoizotopowe: 813,35 Da dla peptydu Semax i 751,43 Da dla peptydu Selank. Przy jonizacji przez elektrorozpylanie w trybie dodatnim należy spodziewać się przede wszystkim następujących sygnałów:

• Semax: [M+H]+ przy m/z 814,36 i [M+2H]2+ przy m/z 407,68; addukt sodowy i potasowy przy m/z odpowiednio 836,34 i 852,31.
• Selank: [M+H]+ przy m/z 752,44, [M+2H]2+ przy m/z 376,72 oraz, dzięki trzem centrom zasadowym, [M+3H]3+ przy m/z 251,49; addukt sodowy leży przy m/z 774,42.

Typowe produkty uboczne różnią się w zależności od cząsteczki. W przypadku peptydu Semax najważniejszą reakcją rozkładu jest utlenianie metioniny: sulfotlenek ([M+H]+ przy m/z 830,35) jest bardziej polarny, w HPLC z odwróconymi fazami eluuje zwykle przed pikiem głównym i czasem pojawia się jako pik podwójny, ponieważ przy atomie siarki powstają dwa diastereoizomery. W przypadku peptydu Selank warianty utlenione są mało prawdopodobne. Przy obu peptydach w grę wchodzą sekwencje błędne z syntezy, np. bez proliny (−97 Da) lub bez glicyny (−57 Da), a przy peptydzie Selank dodatkowo pozostałości grupy ochronnej argininy Pbf (+252 Da). Semax ze względu na fenyloalaninę i metioninę jest z reguły silniej zatrzymywany niż Selank. Ponieważ w obu peptydach brak tryptofanu i tyrozyny, detekcję prowadzi się przy długości fali od 210 do 220 nm, a nie przy 280 nm.

Czystość w procentach powierzchni nie mówi nic o zawartości netto peptydu. W przypadku peptydów zasadowych różnica jest duża: jeśli Selank występuje jako trifluorooctan z trzema przeciwjonami, na przeciwjon przypada rachunkowo niemal jedna trzecia masy, a w postaci octanu – około jednej piątej. W przypadku peptydu Semax, którego grupami zasadowymi są koniec aminowy i histydyna, udział ten jest mniejszy. Dlatego warto sprawdzić, czy certyfikat podaje przeciwjon i ewentualnie zawartość peptydu.

Semax i Selank są regularnie badane zewnętrznie metodą HPLC i spektrometrii mas. Dostępne certyfikaty analizy (COA) znajdziesz w dziale laboratoryjnym; jeśli brak tam certyfikatu, badanie jest oznaczone jako „oczekuje”. Podstawy wyjaśniają poradniki HPLC i spektrometria mas oraz Czystość peptydów badawczych.

Przechowywanie i postępowanie w laboratorium

W postaci liofilizatu oba peptydy najlepiej przechowywać w zimnym, suchym i zaciemnionym miejscu, a przez dłuższy czas w −20 °C. Przed otwarciem fiolka powinna osiągnąć temperaturę pokojową, aby na proszek nie dostały się skropliny. Dla poszczególnych cząsteczek obowiązują następujące zasady:

• Semax: Metionina reaguje z tlenem z powietrza i z nadtlenkami. Fiolkę należy otwierać tylko na krótko, w razie potrzeby w atmosferze gazu obojętnego; w roztworze utlenianie postępuje znacznie szybciej niż w suchym proszku.
• Selank: Sole peptydów zasadowych łatwo pochłaniają wilgoć. Dlatego ważenie należy przeprowadzać sprawnie, fiolkę natychmiast zamykać i przechowywać ze środkiem osuszającym. Reszt wrażliwych na utlenianie brak.

Dalsze wskazówki, także dotyczące zmian temperatury, zawiera poradnik Przechowywanie liofilizowanych peptydów.

Kontekst badawczy

Badania nad obiema cząsteczkami prowadzone są dotychczas bez jednoznacznie przypisanego receptora. Semax jest w badaniach przedklinicznych analizowany przede wszystkim w kontekście układu neurotrofin, konkretnie ekspresji genów BDNF i TrkB; pojedyncze prace dotyczą ponadto receptorów melanokortynowych. Selank jest badany na liniach komórkowych i w modelach gryzoni, z naciskiem na dane dotyczące ekspresji genów GABA-ergicznych i genów związanych ze stanem zapalnym; in vitro dochodzą do tego doświadczenia z enzymami rozkładającymi enkefaliny. Z tych modeli nie można wyprowadzać wniosków dotyczących innych układów.

Wyłącznie do badań – nota prawna

GPeptides wprowadza Semax i Selank do obrotu wyłącznie jako odczynniki laboratoryjne do badań in vitro; nie są one przeznaczone do stosowania na ciele ani wewnątrz ciała ludzi lub zwierząt. GPeptides nie udziela wskazówek dotyczących stosowania; analityka potwierdza tożsamość i czystość odczynnika. Pojedyncze fiolki po 10 mg znajdziesz na stronach produktów Semax i Selank, oba peptydy razem w zestawie Semax + Selank. Dalsze sekwencje zawiera kategoria Neuropeptydy.