Semax e Selank: struttura, analitica e manipolazione nella ricerca

Panoramica: due nomi, due eptapeptidi

Semax e Selank sono peptidi brevi e lineari, composti ciascuno da sette amminoacidi. In entrambi i casi si tratta di nomi triviali; ciascuna molecola è descritta in modo univoco solo da sequenza, formula bruta e numero CAS. Come leggere le denominazioni:

• ACTH(4-7)-Pro-Gly-Pro: i numeri tra parentesi indicano le posizioni nell’ormone di partenza, qui le posizioni da 4 a 7 dell’ormone adrenocorticotropo, seguite dalla sequenza parziale aggiunta.
• H- … -OH: notazione abbreviata per le estremità libere della catena. Un «Ac-» anteposto indicherebbe un’acetilazione, un «-NH2» in coda un’ammide C-terminale.
• Semax + Selank: nome di catalogo di un set di due flaconcini separati, né miscela né molecola a sé.

Struttura nel dettaglio

Entrambe le catene sono costituite da una porzione iniziale di quattro residui di origine naturale e dalla terminazione Pro-Gly-Pro. Dal punto di vista chimico le porzioni iniziali differiscono notevolmente:

• Semax, H-Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH: la metionina porta un tioetere sensibile all’ossidazione, l’acido glutammico un gruppo carbossilico, l’istidina un anello imidazolico, la fenilalanina un residuo aromatico idrofobo. A pH neutro la molecola risulta, secondo il calcolo, leggermente carica negativamente.
• Selank, H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH: la treonina porta un gruppo ossidrilico, la lisina un gruppo amminico primario, l’arginina un gruppo guanidinico. Con N-terminale, lisina e arginina, Selank possiede tre centri basici; a pH neutro è nettamente carico positivamente e molto polare.

Il motivo Pro-Gly-Pro determina la conformazione dell’estremità della catena: la prolina non porta un atomo di idrogeno sull’azoto e il suo anello limita la rotazione dello scheletro. Molte peptidasi scindono solo lentamente i legami sulla prolina; per questo la letteratura specialistica descrive la terminazione come elemento stabilizzante nei confronti della degradazione enzimatica. Altre modifiche sono assenti: nessuna ciclizzazione, nessuna acetilazione o amidazione, nessuna cisteina e quindi nessun ponte disolfuro, nessun complesso metallico.

Distinzione dalle molecole affini

• ACTH(4-10): sequenza parziale naturale Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly; con Semax coincidono solo i primi quattro residui.
• α-MSH: contiene Met-Glu-His-Phe nelle posizioni da 4 a 7, ma è acetilato all’estremità N-terminale e amidato all’estremità C-terminale.
• MT1 e MT2: analoghi dell’α-MSH con norleucina al posto della metionina; MT2 è inoltre chiuso ad anello tramite un ponte lattamico.
• Tuftsina: Thr-Lys-Pro-Arg, un tetrapeptide di 500,6 g/mol, identico ai primi quattro residui di Selank.
• Varianti acetilate e amidate: alcuni cataloghi riportano forme modificate come «N-acetil-Semax amidato». Acetilazione (+42,01 Da) e amidazione (−0,98 Da) spostano insieme la massa monoisotopica di circa 41 Da. I peptidi di GPeptides hanno estremità libere; la spettrometria di massa distingue le due forme in modo univoco.

A cosa prestare attenzione nell’analitica e nel COA

Per la verifica dell’identità contano le masse monoisotopiche: 813,35 Da per Semax e 751,43 Da per Selank. Con la ionizzazione elettrospray in modalità positiva sono attesi soprattutto questi segnali:

• Semax: [M+H]+ a m/z 814,36 e [M+2H]2+ a m/z 407,68; addotti di sodio e di potassio rispettivamente a m/z 836,34 e 852,31.
• Selank: [M+H]+ a m/z 752,44, [M+2H]2+ a m/z 376,72 e, favorito dai tre centri basici, [M+3H]3+ a m/z 251,49; l’addotto di sodio si trova a m/z 774,42.

I sottoprodotti tipici differiscono da molecola a molecola. Per Semax l’ossidazione della metionina è la principale reazione di degradazione: il solfossido ([M+H]+ a m/z 830,35) è più polare, nell’HPLC in fase inversa eluisce per lo più prima del picco principale e compare talvolta come picco doppio, perché sullo zolfo si formano due diastereoisomeri. Per Selank le varianti ossidate sono poco probabili. Per entrambi i peptidi vanno considerate sequenze errate derivanti dalla sintesi, ad esempio prive di prolina (−97 Da) o di glicina (−57 Da), per Selank inoltre residui del gruppo protettivo Pbf dell’arginina (+252 Da). Semax, per via di fenilalanina e metionina, è di norma trattenuto più fortemente di Selank. Poiché a entrambi i peptidi mancano triptofano e tirosina, la rivelazione avviene tra 210 e 220 nm, non a 280 nm.

La purezza in percentuale di area non dice nulla sul contenuto netto di peptide. Nei peptidi basici la differenza è grande: se Selank si presenta come trifluoroacetato con tre controioni, secondo il calcolo poco meno di un terzo della massa è attribuibile al controione, come acetato circa un quinto. Per Semax, con N-terminale e istidina come gruppi basici, la quota è minore. Conviene quindi verificare se il certificato indica il controione ed eventualmente un contenuto di peptide.

Semax e Selank vengono analizzati regolarmente da un laboratorio esterno tramite HPLC e spettrometria di massa. I certificati di analisi (COA) disponibili si trovano nell’area laboratorio; se lì manca un certificato, l’analisi è indicata come in attesa. I fondamenti sono spiegati nelle guide HPLC e spettrometria di massa e Purezza dei peptidi di ricerca.

Conservazione e manipolazione in laboratorio

Come liofilizzati, entrambi i peptidi si conservano al meglio al freddo, all’asciutto e al buio, per periodi più lunghi a −20 °C. Prima dell’apertura il flaconcino dovrebbe raggiungere la temperatura ambiente, così che sulla polvere non arrivi condensa. Per le singole molecole vale quanto segue:

• Semax: la metionina reagisce con l’ossigeno dell’aria e con i perossidi. Il flaconcino va aperto solo brevemente, se necessario sotto gas inerte; in soluzione l’ossidazione procede molto più rapidamente che nella polvere secca.
• Selank: i sali dei peptidi basici assorbono facilmente umidità. Occorre quindi pesare rapidamente, richiudere subito il flaconcino e conservarlo con un essiccante. Residui sensibili all’ossidazione sono assenti.

Ulteriori indicazioni, anche sugli sbalzi di temperatura, sono contenute nella guida Conservare i peptidi liofilizzati.

Contesto di ricerca

La ricerca su entrambe le molecole procede finora senza un recettore assegnato in modo univoco. Semax è studiato nella ricerca preclinica soprattutto in relazione al sistema delle neurotrofine, in particolare all’espressione genica di BDNF e TrkB; singoli lavori riguardano inoltre i recettori delle melanocortine. Selank è studiato su linee cellulari e in modelli di roditori, con particolare attenzione ai dati di espressione di geni GABAergici e legati all’infiammazione; in vitro si aggiungono esperimenti con enzimi che degradano le encefaline. Da questi modelli non si possono dedurre affermazioni su altri sistemi.

Solo per la ricerca: avvertenza legale

GPeptides immette in commercio Semax e Selank esclusivamente come reagenti di laboratorio per la ricerca in vitro; non sono destinati all’uso sul o nel corpo umano o animale. GPeptides non fornisce indicazioni sull’impiego; l’analitica documenta identità e purezza del reagente. I flaconcini singoli da 10 mg ciascuno si trovano sulle pagine prodotto Semax e Selank, entrambi insieme nel set Semax + Selank. Altre sequenze sono raccolte nella categoria Neuropeptidi.