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Due metodi, due domande: l’HPLC risponde a «quanto è puro?», la spettrometria di massa a «è la molecola giusta?». Cosa si nasconde dietro picco, tempo di ritenzione e m/z.
Solo per scopi di ricercaUn reagente peptidico è descritto da due dati indipendenti: quanto materiale estraneo contiene e se la molecola è quella attesa. Al primo risponde la cromatografia, al secondo la spettrometria di massa. Sul certificato i due valori compaiono uno accanto all’altro, ma provengono da misure separate e vanno letti separatamente.
Nella cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) il campione disciolto viene pompato sotto pressione attraverso una colonna. I componenti migrano a velocità diverse a seconda dell’interazione con il materiale della colonna e la lasciano in momenti diversi – il tempo di ritenzione. Un rivelatore (per i peptidi di solito UV a 210–220 nm, dove assorbe il legame peptidico) registra un cromatogramma: un segnale nel tempo con un picco per ogni sostanza separata.
Per i peptidi si lavora quasi sempre in fase inversa: colonna apolare, eluente acqua/acetonitrile con un additivo acido, gradiente crescente. Colonna, gradiente, temperatura e lunghezza d’onda determinano quali sostanze vengono separate e quali finiscono sotto lo stesso picco. Per questo un certificato che non indica le condizioni non è confrontabile con un altro, anche a parità di percentuale.
L’area sotto il picco principale viene rapportata all’area totale dei picchi integrati. Il risultato è la percentuale di area – il numero che nel COA compare come purezza. I picchi secondari derivano tipicamente da sequenze troncate, varianti ossidate o residui di gruppi protettivi della sintesi. Il picco del solvente e il fronte di eluizione non vengono conteggiati: anche le regole di integrazione incidono quindi sul valore finale. Cosa quel valore includa e cosa no è trattato nella guida Purezza dei peptidi di ricerca.
La spettrometria di massa (MS) ionizza il campione e misura il rapporto massa/carica (m/z). Nei metodi a ionizzazione dolce usati per i peptidi la molecola resta intera e porta spesso più cariche, per cui una sola sostanza appare come una serie di segnali. Da questa serie si calcola la massa molecolare, che viene confrontata con il valore teorico della sequenza. Se i due coincidono entro la tolleranza dello strumento, l’identità è confermata.
L’HPLC da sola mostra che una sostanza è dominante – non quale. La MS da sola mostra che la molecola giusta è presente – non in quale proporzione. Solo insieme rispondono alle due domande che un reagente di ricerca deve soddisfare. Come i due risultati vengono riportati insieme sul certificato lo spiega la guida Leggere correttamente un certificato di analisi.
Nessuno dei due copre tutto. Sostanze prive di assorbimento alla lunghezza d’onda impostata, sali inorganici e acqua non compaiono nel cromatogramma; due impurità con tempo di ritenzione simile possono sovrapporsi in un unico picco. Nella MS la resa di ionizzazione varia da sostanza a sostanza, perciò l’altezza dei segnali non è una misura quantitativa. Per questo alle due analisi se ne affiancano altre, come le prove su metalli pesanti ed endotossine; quali test GPeptides commissiona regolarmente è descritto nell’area Analitica & controllo qualità, mentre i certificati disponibili si trovano nell’area laboratorio.
Come un risultato analitico venga documentato e pubblicato è descritto nella guida Controllo qualità: dalla materia prima al certificato.
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Prodotto analizzato, metodo di prova, purezza in percentuale, data del test: un COA vale quanto le informazioni che contiene. Ecco come verificare se un certificato corrisponde alla merce che si ha in mano.
Leggi tutto: Leggere correttamente un certificato di analisi (COA) →Come funziona il controllo qualità in GPeptides: dalla ricezione merce alle analisi esterne regolari fino alla pubblicazione del certificato. La merce senza certificato pubblicato è contrassegnata come «in attesa».
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