HPLC und Massenspektrometrie: Grundlagen der Peptid-Analytik

HPLC: Trennen und messen

Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird die gelöste Probe unter Druck durch eine Säule gepumpt. Die Bestandteile wandern je nach Wechselwirkung mit dem Säulenmaterial unterschiedlich schnell und verlassen die Säule zu unterschiedlichen Zeiten – der Retentionszeit. Ein Detektor (bei Peptiden meist UV bei 210–220 nm) zeichnet ein Chromatogramm auf: ein Signal über die Zeit mit einem Peak je Substanz.

Säule, Laufmittel, Gradient

Für Peptide wird üblicherweise mit Umkehrphasen gearbeitet: Das Säulenmaterial ist unpolar, häufig C18-modifiziertes Kieselgel, das Laufmittel polar. Gemischt wird aus Wasser und einem organischen Anteil, meist Acetonitril, jeweils mit einem sauren Zusatz. Während des Laufs steigt der organische Anteil – dieser Gradient löst stärker gebundene Moleküle nach und nach von der Säule. Säule, Gradient, Temperatur und Flussrate bestimmen gemeinsam, wie gut zwei ähnliche Substanzen getrennt werden. Deshalb gehören diese Bedingungen auf ein aussagekräftiges Zertifikat; ohne sie lässt sich ein Chromatogramm nicht einordnen. Eine knappe Übersicht zum Verfahren bietet auch das DocCheck Flexikon.

Wie daraus eine Reinheit wird

Die Fläche unter dem Hauptpeak wird ins Verhältnis zur Gesamtfläche aller Peaks gesetzt. Das Ergebnis sind Flächenprozent – die Zahl, die im COA als Reinheit steht. Nebenpeaks stammen typischerweise von verkürzten Sequenzen, oxidierten Varianten oder Schutzgruppenresten aus der Synthese. Vorausgesetzt ist dabei, dass die Nebenbestandteile bei der gewählten Wellenlänge absorbieren und sauber vom Hauptpeak getrennt werden: Was mit ihm zusammenfällt oder kein Signal erzeugt, taucht in der Rechnung nicht auf. Was eine Prozentzahl deshalb nicht abdeckt, erklärt der Ratgeber Reinheit von Research-Peptiden.

Massenspektrometrie: Identität

Die Massenspektrometrie (MS) ionisiert die Probe und misst das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z). Peptide tragen dabei häufig mehrere Ladungen, sodass ein Molekül als Serie von Signalen erscheint. Aus diesen lässt sich die molekulare Masse berechnen und mit dem theoretischen Wert der Sequenz vergleichen. Stimmen beide überein, ist die Identität bestätigt.

Von m/z zur Molekülmasse

Üblich ist die Elektrospray-Ionisation: Die Probe wird aus einer Lösung versprüht und nimmt dabei Protonen auf. Jedes Signal der Serie gehört zum selben Molekül, nur mit anderer Ladungszahl; aus dem Abstand der Signale ergibt sich die Ladung und daraus die neutrale Masse. Dieser Rechenschritt heißt Dekonvolution. Verglichen wird innerhalb einer Toleranz, die von Gerät und Auflösung abhängt und im Bericht stehen sollte. Eine Abweichung von mehreren Dalton ist kein Rundungsfehler, sondern ein Hinweis auf eine andere Verbindung – etwa auf eine oxidierte Variante oder eine fehlende Aminosäure.

Warum beides nötig ist

HPLC allein zeigt, dass eine Substanz dominiert – nicht welche. MS allein zeigt, dass das richtige Molekül vorhanden ist – nicht in welchem Anteil. Erst zusammen beantworten sie die beiden Fragen, die ein Forschungsreagenz erfüllen muss. Häufig werden beide Verfahren gekoppelt (LC-MS): Erst wird getrennt, dann wird jedem Peak eine Masse zugeordnet. So lässt sich auch ein Nebenpeak benennen, statt ihn nur zu zählen.

Begriffe aus dem Zertifikat

• Retentionszeit (RT): Zeit bis zum Austritt aus der Säule; charakteristisch für die Substanz unter den gewählten Bedingungen.
• Flächenprozent: Anteil des Hauptpeaks an der Gesamtfläche – die Reinheitsangabe.
• m/z: Masse-zu-Ladung-Verhältnis eines Ions im Massenspektrum.
• Theoretische Masse: Aus der Sequenz berechnete Molekülmasse; Vergleichswert für die MS.
• Gefundene Masse: der aus dem Spektrum ermittelte Wert, der dem theoretischen gegenübersteht.
• Basislinie: das Signal ohne Probe; ein unruhiger Verlauf erschwert die Integration kleiner Peaks.

Was die Verfahren nicht leisten

Beide Methoden beschreiben die untersuchte Probe zum Prüfzeitpunkt, nicht den Zustand nach längerer Lagerung. Sie sagen außerdem nichts über Wassergehalt, Gegenionen oder Schwermetalle aus; dafür gibt es eigene Prüfungen. Wie die Ergebnisse in einem Dokument zusammengeführt werden, zeigt der Ratgeber Analysezertifikat richtig lesen; welche Prüfungen GPeptides beauftragt, beschreibt der Ratgeber Qualitätskontrolle: Vom Rohstoff bis zum Zertifikat. Die veröffentlichten Zertifikate stehen im Laborbereich.