HPLC y espectrometría de masas: fundamentos de la analítica de péptidos

HPLC: separar y medir

En la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), la muestra disuelta se bombea a presión a través de una columna. Los componentes avanzan a distinta velocidad según su interacción con el material de la columna y salen de ella en momentos distintos: el tiempo de retención. Un detector, en péptidos normalmente UV a 210–220 nm, donde absorbe el enlace peptídico, registra un cromatograma: una señal en función del tiempo con un pico por sustancia.

Columna, gradiente y condiciones

El análisis de péptidos se hace casi siempre en fase reversa: el material de la columna es apolar y la fase móvil, una mezcla de agua y acetonitrilo con un aditivo ácido. La proporción de disolvente orgánico aumenta durante la medición; eso es el gradiente. Cuanto más apolar es un componente, más tarde se eluye. Columna, gradiente, temperatura y longitud de onda forman las condiciones del método: si cambian, cambian los tiempos de retención y puede cambiar el porcentaje. Un certificado sin condiciones documentadas es difícil de comparar.

Cómo se obtiene la pureza

El área bajo el pico principal se pone en relación con el área total de todos los picos. El resultado es el porcentaje de área, la cifra que figura como pureza en el COA. Los picos secundarios proceden normalmente de secuencias truncadas, variantes oxidadas o restos de grupos protectores de la síntesis. Dos detalles determinan el número: dónde empieza y termina la integración de cada pico y qué señales quedan bajo el umbral. Qué describe ese valor y qué no se detalla en la guía Pureza de los péptidos de investigación.

Espectrometría de masas: identidad

La espectrometría de masas (MS) ioniza la muestra y mide la relación masa/carga (m/z). Con ionización por electrospray, los péptidos adquieren varias cargas, de modo que una misma molécula aparece como una serie de señales con distintos estados de carga. De esa serie se calcula la masa molecular y se compara con el valor teórico de la secuencia. Si ambos coinciden dentro de la tolerancia del equipo, la identidad queda confirmada.

Por qué se necesitan ambos

La HPLC por sí sola muestra que una sustancia predomina, no cuál. La MS por sí sola muestra que la molécula correcta está presente, no en qué proporción. Solo juntas responden a las dos preguntas que debe cumplir un reactivo de investigación. Por eso un certificado completo recoge los dos resultados; cómo se leen se explica en la guía Leer correctamente un certificado de análisis.

Términos del certificado

• Tiempo de retención (RT): tiempo hasta la salida de la columna; característico de la sustancia en las condiciones elegidas.
• Porcentaje de área: proporción del pico principal respecto al área total, es decir, el dato de pureza.
• m/z: relación masa/carga de un ion en el espectro de masas.
• Masa teórica: masa molecular calculada a partir de la secuencia; valor de referencia para la MS.
• Masa monoisotópica y masa media: dos maneras de calcular la masa; solo deben compararse valores del mismo tipo.

Lo que estos métodos no responden

Ninguno indica cuánto péptido neto contiene el polvo del vial: para eso hacen falta el análisis de aminoácidos o la medición del contenido de agua. Tampoco cubren metales pesados ni endotoxinas, que se analizan por separado. Y un resultado describe la muestra en la fecha del análisis, no el estado posterior del material, que depende del almacenamiento.

Qué analiza GPeptides

Los péptidos de GPeptides se analizan periódicamente en un laboratorio externo e independiente, que determina identidad por MS, pureza por HPLC, metales pesados y endotoxinas. Los certificados disponibles se publican en el área de laboratorio e indican la mercancía analizada y la fecha del análisis; el producto sin certificado publicado figura como «pendiente». Qué análisis se encargan periódicamente se describe en el área Analítica y control de calidad.

El camino de una muestra hasta el certificado publicado se detalla en la guía sobre el el recorrido de la mercancía.