Kagrilintyd: budowa, analityka i postępowanie w badaniach

Przegląd i nazewnictwo

Kagrilintyd, w katalogu i w języku angielskim Cagrilintide, to międzynarodowa nazwa niezastrzeżona (INN) syntetycznego peptydu wywodzącego się z ludzkiej amyliny. WHO opublikowała tę nazwę w 2020 roku na liście 123 proponowanych INN, z określeniem klasy: analog amyliny. GPeptides oferuje odczynnik w postaci liofilizowanej, w fiolce z naważką 10 mg.

• Numer CAS: 1415456-99-3
• UNII: AO43BIF1U8
• PubChem CID: 171397054
• Wzór sumaryczny: C194H312N54O59S2, masa molowa około 4409,1 g/mol

Ostrożnie przy porównywaniu z bazami danych: obliczona nazwa IUPAC w PubChem podaje dla kilku reszt między pozycjami 27 a 37 konfigurację D; INN, nazwa CAS i rejestr substancji GSRS opisują konsekwentnie L-aminokwasy. Kodów SMILES i InChIKey z tego wpisu nie należy więc używać bez sprawdzenia.

Budowa w szczegółach

Szkielet obejmuje, tak jak ludzka amylina, 37 aminokwasów, zapisanych w blokach po dziesięć: KCNTATCATQ RLAEFLRHSS NNFGPILPPT NVGSNTP-NH2. Cząsteczkę kształtują cztery cechy:

1. Sześć podstawień względem ludzkiej amyliny: N14E, V17R, A25P, S28P, S29P i Y37P. Kwas glutaminowy 14 i arginina 17 leżą w odstępie trzech pozycji po tej samej stronie helisy; ich przeciwnie naładowane łańcuchy boczne opisuje się jako mostek solny stabilizujący helisę. Ludzka amylina ma skłonność do tworzenia włókienek amyloidowych, stąd jej druga nazwa IAPP (Islet Amyloid Polypeptide); przejęte z pramlintydu reszty proliny w pozycjach 25, 28 i 29 słabo wpasowują się w harmonijki β.
2. Mostek disiarczkowy: Cys2 i Cys7 zamykają reszty od 2 do 7 w pierścień 20-członowy. WHO numeruje według białka prekursorowego i zapisuje „(35-40)-disulfide”; chodzi o ten sam mostek.
3. Lipidacja: Do grupy α-aminowej lizyny 1 przyłączony jest przez łącznik L-γ-glutamylowy monoamid kwasu ikozanodiowego, nierozgałęzionego kwasu dikarboksylowego C20. Łańcuch węglowodorowy nadaje cząsteczce charakter amfifilowy; zdolne do jonizacji pozostają grupa karboksylowa na końcu łańcucha, grupa α-karboksylowa łącznika i grupa ε-aminowa lizyny.
4. Koniec karboksylowy: amid proliny zamiast amidu tyrozyny; łańcuch nie zawiera więc już tyrozyny.

Przy obojętnym pH lizynie 1, argininom 11 i 17 oraz częściowo histydynie 18 przeciwstawiają się rachunkowo trzy karboksylany: kwas glutaminowy 14, łącznik i koniec kwasu tłuszczowego. Ładunek netto jest bliski zeru.

Odróżnienie od pokrewnych cząsteczek

• Ludzka amylina (IAPP, INN amlintyd): 37 reszt, Cys2–Cys7, amid tyrozyny na końcu karboksylowym, bez lipidacji.
• Pramlintyd: ludzka amylina z A25P, S28P i S29P. Kagrilintyd przejmuje te reszty proliny i uzupełnia je o N14E, V17R, Y37P oraz dikarboksylowy kwas tłuszczowy.
• Kalcytonina łososiowa: 32 reszty, mostek disiarczkowy Cys1–Cys7, również amid proliny na końcu karboksylowym; często stosowany ligand porównawczy w pracach nad wiązaniem z receptorem.
• Analogi inkretyn, takie jak GLP-3: są skierowane na receptory GLP-1, GIP i częściowo glukagonu. Z kagrilintydem GLP-3 dzieli dikarboksylowy kwas tłuszczowy C20, ale nie sekwencję ani receptor docelowy.

Na co zwrócić uwagę w analityce i COA

1. Oczekiwana masa: monoizotopowa 4406,25 Da, średnia około 4409,1 Da. Rachunkowo przy nieco ponad 4,4 kDa pik M+2 jest mniej więcej trzykrotnie intensywniejszy niż pik monoizotopowy; należy więc sprawdzić, do czego odnosi się wartość po dekonwolucji. Wpis w bazie danych z O58 to błąd zapisu; do podanej tam masy pasuje wyłącznie O59.
2. Stany naładowania: Bez wolnego końca aminowego przy jonizacji przez elektrorozpylanie prawdopodobne są niskie stany naładowania, w odniesieniu do masy średniej [M+3H]3+ przy m/z ≈ 1470,7 i [M+4H]4+ przy m/z ≈ 1103,3.
3. Mostek disiarczkowy: Zredukowana, otwarta forma jest cięższa o 2,02 Da, w jonie czterokrotnie naładowanym to tylko 0,5 m/z. Wewnątrzcząsteczkowe przegrupowanie jest przy jednym mostku wykluczone, jednak w wyniku wymiany disiarczkowej mogą powstawać dimery. Ich jon ośmiokrotnie naładowany wypada przy tym samym m/z co czterokrotnie naładowany monomer, ale wykazuje piki izotopowe w odstępie 0,125 zamiast 0,25 m/z i można go ponadto odróżnić na podstawie czasu retencji.
4. Lipidacja: Bez dikarboksylowego kwasu tłuszczowego masa jest niższa o 324,27 Da, bez kwasu tłuszczowego i łącznika – o 453,31 Da. Łańcuch acylowy wyraźnie wydłuża retencję w HPLC z odwróconymi fazami.
5. Deamidacja i sekwencje błędne: Pięć reszt asparaginy i glutamina 10 mogą ulegać deamidacji (+0,98 Da); szczególnie podatny motyw Asn-Gly nie występuje. Sekwencje błędne powstałe w syntezie są lżejsze na przykład o 97,05 Da (prolina) lub 114,04 Da (asparagina).
6. Utlenianie i UV: Brak metioniny, tryptofanu i tyrozyny. Sygnał przy +16 Da pojawia się więc rzadziej niż w przypadku wielu peptydów; przy 280 nm cząsteczka prawie nie absorbuje, dlatego czystość oznacza się zwykle przy 210–220 nm.
7. Przeciwjony: Trifluorooctan (TFA) lub octan wiążą się z lizyną, argininami i ewentualnie histydyną; cztery związane cząsteczki kwasu zwiększają masę formułową o około 456 g/mol (TFA) lub 240 g/mol (kwas octowy). Czystość HPLC jako udział powierzchni piku głównego tego nie obejmuje, a zawartość netto peptydu odnosi się do całej naważki.

Tożsamość i czystość Cagrilintide są regularnie badane zewnętrznie metodą HPLC i spektrometrii mas. Dostępne certyfikaty analizy (COA) znajdziesz w dziale laboratoryjnym; jeśli certyfikat nie został zamieszczony, badanie jest tam oznaczone jako „oczekuje”. Jak interpretować chromatogram i widmo mas z certyfikatu, wyjaśniają poradniki HPLC i spektrometria mas oraz Jak prawidłowo czytać certyfikat analizy.

Przechowywanie i postępowanie w laboratorium

Liofilizat przechowuje się w suchym i chłodnym miejscu, z ochroną przed światłem, a długoterminowo w temperaturze −20 °C lub niższej. Schłodzona fiolka powinna przed otwarciem osiągnąć w stanie zamkniętym temperaturę pokojową, aby nie tworzyły się skropliny. Specyficznie dla tej cząsteczki dochodzą następujące kwestie:

• Amfifilowość: Peptydy lipidowane mogą w roztworze wykazywać skłonność do samoasocjacji i przywierać do powierzchni.
• Środki redukujące: DTT lub TCEP otwierają mostek disiarczkowy i nie nadają się do doświadczeń z nienaruszoną cząsteczką.
• Wartość pH: Warunki zasadowe sprzyjają wymianie disiarczkowej i deamidacji.

Roztwory lepiej podzielić na alikwoty, niż wielokrotnie je zamrażać i rozmrażać. Więcej na ten temat w poradniku Przechowywanie liofilizowanych peptydów.

Kontekst badawczy

Obszarem badań kagrilintydu jest układ receptorów amyliny i kalcytoniny, analizowany in vitro i w modelach przedklinicznych. Receptor kalcytoniny (CTR) jest receptorem klasy B sprzężonym z białkiem G; wraz z RAMP1, RAMP2 lub RAMP3 tworzy receptory amyliny AMY1R, AMY2R i AMY3R. Kagrilintyd opisano jako nieselektywnego agonistę CTR i wszystkich trzech receptorów amyliny; badane są na przykład wiązanie i przekazywanie sygnału w układach komórkowych.

Wyłącznie do badań – nota prawna

W GPeptides Cagrilintide jest dostępny wyłącznie jako odczynnik laboratoryjny do doświadczeń in vitro. Nie jest przeznaczony do stosowania u ludzi ani zwierząt i nie jest oferowany jako produkt leczniczy. GPeptides nie wypowiada się na temat stosowania ani działania; raporty z badań dokumentują wyłącznie tożsamość i czystość. Cenę i dostępność podaje strona produktu Cagrilintide, pokrewne cząsteczki – kategoria analogi inkretyn.