Cagrilintide: struttura, analitica e manipolazione nella ricerca

Panoramica e denominazione

La cagrilintide, in catalogo Cagrilintide, è la denominazione comune internazionale (INN) di un peptide sintetico derivato dall’amilina umana. L’OMS ha pubblicato il nome nel 2020 nella lista 123 delle INN proposte, con la denominazione di classe «analogo dell’amilina». GPeptides offre il reagente liofilizzato in flaconcino con una quantità pesata di 10 mg.

• Numero CAS: 1415456-99-3
• UNII: AO43BIF1U8
• PubChem CID: 171397054
• Formula molecolare: C194H312N54O59S2, massa molare circa 4409,1 g/mol

Attenzione nel confronto con le banche dati: il nome IUPAC calcolato da PubChem riporta configurazioni D per diversi residui tra le posizioni 27 e 37, mentre INN, nome CAS e il registro delle sostanze GSRS descrivono esclusivamente L-amminoacidi. SMILES e InChIKey di questa voce non vanno quindi ripresi senza verifica.

Struttura nel dettaglio

Come nell’amilina umana, lo scheletro comprende 37 amminoacidi, qui annotati in blocchi di dieci: KCNTATCATQ RLAEFLRHSS NNFGPILPPT NVGSNTP-NH2. Quattro caratteristiche definiscono la molecola:

1. Sei sostituzioni rispetto all’amilina umana: N14E, V17R, A25P, S28P, S29P e Y37P. L’acido glutammico 14 e l’arginina 17 distano tre posizioni e si trovano sullo stesso lato dell’elica; le loro catene laterali di carica opposta sono descritte come ponte salino che stabilizza l’elica. L’amilina umana tende a formare fibrille amiloidi, da cui il secondo nome IAPP (Islet Amyloid Polypeptide); le proline nelle posizioni 25, 28 e 29, riprese dalla pramlintide, si inseriscono male nei foglietti β.
2. Ponte disolfuro: Cys2 e Cys7 chiudono i residui da 2 a 7 in un anello a 20 membri. L’OMS numera in base alla proteina precursore e scrive «(35-40)-disulfide»; si intende lo stesso ponte.
3. Lipidazione: al gruppo α-amminico della lisina 1 è legata, tramite un linker L-γ-glutamilico, la monoammide dell’acido eicosandioico, un acido bicarbossilico C20 non ramificato. La catena idrocarburica rende la molecola anfifilica; restano ionizzabili il gruppo carbossilico all’estremità della catena, il gruppo α-carbossilico del linker e il gruppo ε-amminico della lisina.
4. Estremità C-terminale: prolinammide al posto della tirosinammide; la catena non contiene quindi più tirosina.

A pH neutro, secondo il calcolo, la lisina 1, le arginine 11 e 17 e in parte l’istidina 18 si contrappongono a tre carbossilati: l’acido glutammico 14, il linker e l’estremità dell’acido grasso. La carica netta è prossima allo zero.

Distinzione dalle molecole affini

• Amilina umana (IAPP, INN amlintide): 37 residui, Cys2–Cys7, tirosinammide all’estremità C-terminale, senza lipidazione.
• Pramlintide: amilina umana con A25P, S28P e S29P. La cagrilintide riprende queste proline e aggiunge N14E, V17R, Y37P e il diacido grasso.
• Calcitonina di salmone: 32 residui, ponte disolfuro Cys1–Cys7, anch’essa con prolinammide all’estremità C-terminale; un ligando di confronto comune negli studi sul legame ai recettori.
• Analoghi incretinici come GLP-3: hanno come bersaglio i recettori di GLP-1 e GIP e in parte quello del glucagone. Con la cagrilintide GLP-3 condivide il diacido grasso C20, ma non la sequenza né il recettore bersaglio.

A cosa prestare attenzione nell’analitica e nel COA

1. Massa attesa: 4406,25 Da monoisotopica, circa 4409,1 Da come valore medio. Secondo il calcolo, a poco più di 4,4 kDa il picco M+2 è circa tre volte più intenso di quello monoisotopico; conviene quindi verificare a che cosa si riferisca un valore deconvoluto. Un dato di banca dati con O58 è un errore di battitura; alla massa lì indicata corrisponde solo O59.
2. Stati di carica: senza estremità N-terminale libera, con la ionizzazione elettrospray sono plausibili stati di carica bassi: riferiti alla massa media, [M+3H]3+ a m/z ≈ 1470,7 e [M+4H]4+ a m/z ≈ 1103,3.
3. Ponte disolfuro: la forma ridotta, aperta, è più pesante di 2,02 Da, il che nello ione con quattro cariche corrisponde ad appena 0,5 m/z. Con un solo ponte è escluso un riarrangiamento intramolecolare, ma tramite scambio di disolfuro possono formarsi dimeri. Il loro ione con otto cariche cade allo stesso m/z del monomero con quattro cariche, ma mostra picchi isotopici a una distanza di 0,125 anziché 0,25 m/z e si può inoltre distinguere in base al tempo di ritenzione.
4. Lipidazione: senza diacido grasso la massa è inferiore di 324,27 Da, senza diacido grasso e linker di 453,31 Da. La catena acilica prolunga nettamente la ritenzione nell’HPLC in fase inversa.
5. Deamidazione e sequenze errate: cinque asparagine e la glutammina 10 possono deamidarsi (+0,98 Da); manca il motivo Asn-Gly, particolarmente suscettibile. Le sequenze errate derivanti dalla sintesi hanno una massa inferiore, ad esempio, di 97,05 Da (prolina) o 114,04 Da (asparagina).
6. Ossidazione e UV: metionina, triptofano e tirosina sono assenti. Un segnale a +16 Da è quindi più raro che in molti peptidi; a 280 nm la molecola assorbe pochissimo, per cui la purezza viene di norma determinata tra 210 e 220 nm.
7. Controioni: il trifluoroacetato (TFA) o l’acetato si legano a lisina, arginine ed eventualmente istidina; quattro molecole di acido legate aumentano la massa formula di circa 456 g/mol (TFA) o 240 g/mol (acido acetico). La purezza HPLC come quota di area del picco principale non ne tiene conto, mentre il contenuto netto di peptide si riferisce all’intera quantità pesata.

Identità e purezza di Cagrilintide sono verificate regolarmente tramite test esterni di HPLC e spettrometria di massa. I certificati di analisi (COA) disponibili si trovano nell’area laboratorio; in assenza di un certificato archiviato, l’analisi vi è contrassegnata come «in attesa». Come interpretare cromatogramma e spettro di massa di un certificato lo spiegano le guide HPLC e spettrometria di massa e Leggere correttamente un certificato di analisi.

Conservazione e manipolazione in laboratorio

Il liofilizzato va conservato all’asciutto, al riparo dalla luce e al fresco, a lungo termine a −20 °C o a temperature inferiori. Prima dell’apertura, un flaconcino refrigerato va lasciato chiuso finché non raggiunge la temperatura ambiente, così che non si formi condensa. A ciò si aggiungono aspetti specifici della molecola:

• Anfifilia: in soluzione i peptidi lipidati possono tendere all’autoassociazione e aderire alle superfici.
• Agenti riducenti: DTT o TCEP aprono il ponte disolfuro e non sono adatti agli esperimenti con la molecola intatta.
• pH: le condizioni alcaline favoriscono lo scambio di disolfuro e la deamidazione.

Le soluzioni vanno preferibilmente suddivise in aliquote anziché congelate e scongelate ripetutamente. Maggiori dettagli nella guida Conservare i peptidi liofilizzati.

Contesto di ricerca

L’ambito di ricerca della cagrilintide è il sistema recettoriale dell’amilina e della calcitonina, studiato in vitro e in modelli preclinici. Il recettore della calcitonina (CTR) è un recettore accoppiato a proteine G di classe B; insieme a RAMP1, RAMP2 o RAMP3 forma i recettori dell’amilina AMY1R, AMY2R e AMY3R. La cagrilintide è descritta come agonista non selettivo del CTR e di tutti e tre i recettori dell’amilina; si studiano, ad esempio, il legame e la trasduzione del segnale in sistemi cellulari.

Solo per la ricerca: avvertenza legale

Presso GPeptides Cagrilintide è disponibile esclusivamente come reagente di laboratorio per esperimenti in vitro. Non è destinato all’uso sull’uomo o sugli animali e non è commercializzato come medicinale. GPeptides non si esprime su impiego o effetti; i rapporti di prova documentano soltanto identità e purezza. Prezzo e disponibilità sono riportati sulla pagina prodotto Cagrilintide, le molecole affini nella categoria Analoghi incretinici.