Melanotan I i II: budowa, analityka i praca z odczynnikami w badaniach

Przegląd: co kryje się za MT1 i MT2

Melanotan I i Melanotan II to nazwy zwyczajowe dwóch syntetycznych peptydów, które wywodzą się od hormonu α-melanotropowego (α-MSH). Katalog prowadzi je jako MT1 i MT2, publikacje dodatkowo jako MT-I, MT-II lub MTII. Cyfry rzymskie nie oznaczają kolejnych generacji tej samej cząsteczki, lecz dwa odrębne związki o różnych wzorach sumarycznych.

Dla MT1 w użyciu są ponadto nazwa INN afamelanotyd oraz zapis NDP-MSH. Przy przeszukiwaniu literatury wskazana jest ostrożność: skróty MT1 i MT2 oznaczają także oba receptory melatoninowe oraz izoformy metalotionein. Jednoznaczne wyszukiwanie zapewnia numer CAS: dla MT1 75921-69-6, dla MT2 121062-08-6.

Budowa w szczegółach

Numeracja pozycji odpowiada numeracji naturalnego α-MSH. Oba peptydy mają trzy wspólne cechy:

• Norleucyna w pozycji 4: ten nieproteinogenny aminokwas jest izosteryczny z metioniną, ale nie zawiera podatnego na utlenianie atomu siarki tioeterowej.
• D-fenyloalanina w pozycji 7: odwrócona konfiguracja znajduje się w środku tetrapeptydu His-Phe-Arg-Trp, który w literaturze uchodzi za centralny motyw rozpoznawczy receptorów melanokortynowych.
• Zabezpieczone końce: N-koniec jest acetylowany, a C-koniec amidowany. Brakuje więc wolnej grupy aminowej i wolnej grupy karboksylowej, które stanowią punkt ataku amino- i karboksypeptydaz.

MT2 idzie o dwa kroki dalej. Obejmuje tylko pozycje od 4 do 10, a w pozycjach 5 i 10 znajdują się kwas asparaginowy i lizyna. Ich łańcuchy boczne są połączone z odszczepieniem wody w laktam; makrocykl liczy 23 atomy w pierścieniu, co w nazwie IUPAC widać po szkielecie heksaazacyklotrikozanu. Pierścień utrzymuje motyw rozpoznawczy w nielicznych preferowanych konformacjach. Ponieważ ponadto oba końce są zablokowane, w MT2 jako jonizowalne łańcuchy boczne pozostają tylko histydyna i arginina; MT1 zawiera dodatkowo wolną lizynę, kwas glutaminowy i tyrozynę.

Odróżnienie od pokrewnych cząsteczek

• α-MSH: naturalny wzorzec, liniowy, 13 reszt, z metioniną w pozycji 4 i L-fenyloalaniną w pozycji 7.
• MT1: liniowy, 13 reszt, C78H111N21O19, około 1646,8 g/mol; w literaturze łączony przede wszystkim z receptorem MC1.
• MT2: cykliczny, 7 reszt, C50H69N15O9, około 1024,2 g/mol; opisywany jako nieselektywny agonista kilku podtypów receptorów melanokortynowych.
• SHU9119: nie jest produktem katalogowym, lecz często cytowaną cząsteczką referencyjną: MT2 z D-2-naftyloalaniną w pozycji 7 (C54H71N15O9), opisywany na receptorach MC3 i MC4 jako antagonista. Pojedyncza reszta przesuwa tu profil receptorowy.
• KPV: niezmieniony tripeptyd z pozycji od 11 do 13 w postaci wolnego kwasu; jako odcinek sekwencji zawarty w MT1, ale nie w MT2.
• GHK-Cu: ta sama kategoria katalogowa, ale kompleks peptydu z miedzią bez związku z α-MSH.

Na co zwracać uwagę w analityce i COA

W spektrometrii mas z elektrorozpylaniem pojawia się, zależnie od liczby grup ulegających protonacji, kilka stanów naładowania (wartości monoizotopowe, zaokrąglone):

• MT2 (M = 1023,54 Da): [M+H]⁺ przy m/z 1024,55, [M+2H]²⁺ przy m/z 512,78, addukt sodowy [M+Na]⁺ przy m/z 1046,53.
• MT1 (M = 1645,84 Da): [M+2H]²⁺ przy m/z 823,93 i [M+3H]³⁺ przy m/z 549,62; w zależności od warunków pomiaru występuje także [M+H]⁺ przy m/z 1646,84.

Produkty uboczne zdradza różnica mas:

• Sekwencje błędne: lżejsze o masę jednej reszty, na przykład minus 186 Da bez tryptofanu.
• Brak acetylacji: minus 42 Da.
• Wolny kwas zamiast amidu: plus niespełna 1 Da; bez pomiaru wysokorozdzielczego łatwo to przeoczyć.
• Utlenienie: plus 4, 16 lub 32 Da. Ponieważ norleucyna zastępuje metioninę, najbardziej prawdopodobnym miejscem ataku w obu cząsteczkach jest reszta tryptofanu.
• Tylko w MT2: niezamknięty prekursor (plus 18 Da) i cykliczne dimery. Dimer naładowany dwukrotnie wypada przy tym samym m/z co monomer naładowany jednokrotnie; można go odróżnić po o połowę mniejszym odstępie izotopowym lub po czasie retencji.
• Diastereoizomery: na przykład z L- zamiast D-fenyloalaniny w pozycji 7. Przy tej samej masie rozdziela je wyłącznie chromatografia.

Czystość HPLC podaje udział powierzchni piku głównego, a nie udział peptydu w naważce. Peptydy syntetyczne występują w postaci soli, najczęściej octanu lub trifluorooctanu (TFA); przeciwjony i woda resztkowa zwiększają masę w fiolce, nie wchodząc do procentów powierzchni. Partnerami wiązania przeciwjonów są w MT2 arginina i histydyna, a w MT1 dodatkowo lizyna. Ten udział ujmuje zawartość netto peptydu – wielkość niezależna od czystości. MT1 i MT2 są regularnie badane zewnętrznie metodami HPLC i spektrometrii mas. Dostępne certyfikaty analizy (COA) znajdują się w dziale laboratoryjnym; dopóki nie ma tam certyfikatu, wynik badania jest jeszcze oczekiwany. Temat pogłębiają poradniki HPLC i spektrometria mas, Jak prawidłowo czytać certyfikat analizy i Czystość peptydów badawczych.

Przechowywanie i praca w laboratorium

Przechowywane jako liofilizat w suchym, ciemnym i chłodnym miejscu, oba peptydy są znacznie trwalsze niż w roztworze; na dłuższy czas odpowiednia jest zamrażarka. Należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:

• Światło i tlen: tryptofan jest wrażliwy na światło i podatny na utlenianie. Fiolki należy przechowywać z dala od światła i otwierać tylko na krótko.
• Wilgoć: liofilizowane sole peptydów są higroskopijne. Schłodzoną fiolkę przed otwarciem należy pozostawić zamkniętą do osiągnięcia temperatury pokojowej, aby na proszku nie osadziła się skroplona woda.
• Roztwory: są mniej stabilne niż liofilizat; należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

Pierścień czyni MT2 sztywniejszym, ale nie chroni ani przed utlenianiem, ani przed wilgocią. Ogólne wskazówki zawiera poradnik Przechowywanie liofilizowanych peptydów.

Kontekst badawczy

Obie cząsteczki są badane w pracach in vitro i przedklinicznych nad układem melanokortynowym. Z użyciem MT1 bada się przede wszystkim w modelach komórkowych kaskadę sygnałową receptora MC1; znakowany radioaktywnie NDP-MSH jest ponadto rozpowszechnionym znacznikiem w testach wiązania. MT2 ze względu na szeroki profil służy jako agonista referencyjny do porównywania sygnałów na receptorach MC1, MC3, MC4 i MC5, często razem z antagonistami takimi jak SHU9119.

Wyłącznie do badań: nota prawna

MT1 i MT2 są wprowadzane do obrotu przez GPeptides wyłącznie jako odczynniki laboratoryjne do badań in vitro. Nie są przeznaczone do stosowania na ciele ani wewnątrz ciała ludzi lub zwierząt i nie są oferowane ani jako produkty lecznicze, ani jako kosmetyki. GPeptides nie podaje informacji o stosowaniu ani działaniu. Naważkę i cenę podają strony produktów MT1 i MT2; dalsze pokrewne cząsteczki obejmuje kategoria Melanokortyny & peptydy miedziowe.