TB-500: budowa, analityka i praca z odczynnikiem w badaniach

Przegląd: co kryje się za nazwą TB-500

TB-500 to nazwa katalogowa i handlowa, a nie INN ani nazwa systematyczna. „TB” odsyła do tymozyny beta 4, białka, z którego pochodzi sekwencja. Liczba 500 nie jest natomiast informacją chemiczną: nie opisuje ani długości łańcucha, ani masy. W katalogu cząsteczka występuje dwukrotnie: jako pojedynczy produkt TB-500 o zawartości 5 mg oraz jako składnik blendu BPC-157 + TB500 o łącznej naważce 10 mg. O tożsamości rozstrzygają nie nazwy, lecz sekwencja, wzór sumaryczny i masa zmierzona w certyfikacie.

Budowa w szczegółach

Skrócony zapis Ac-LKKTETQ czyta się od N- do C-końca. „Ac” oznacza grupę acetylową (CH₃CO–), związaną kowalencyjnie z grupą aminową pierwszej reszty. Dalej następują leucyna (L), dwukrotnie lizyna (K), treonina (T), kwas glutaminowy (E), ponownie treonina oraz glutamina (Q); E i Q łatwo pomylić.

Wzór sumaryczny to C38H68N10O14, średnia masa molowa wynosi około 889,0 g/mol, a masa monoizotopowa 888,49 Da. Wszystkie reszty występują w formie L; wraz z dwoma centrami stereogenicznymi każdej z treonin daje to łącznie dziewięć takich centrów. Peptyd jest liniowy, nie ma mostka disiarczkowego i nie jest cyklizowany.

Pod względem chemicznym istotne są oba końce. Acetylacja zastępuje wolną, dodatnio naładowaną grupę aminową obojętnym wiązaniem amidowym. Początek łańcucha przypomina tym samym wiązanie peptydowe, które w białku występuje w tym miejscu, i jest trudniej dostępny dla aminopeptydaz. C-koniec nie jest amidowany; wariant amidowany byłby lżejszy zaledwie o około 0,98 Da i dałoby się go pewnie odróżnić tylko pomiarem wysokorozdzielczym. Przy obojętnym pH dwóm protonowanym łańcuchom bocznym lizyny odpowiadają dwa ładunki ujemne: łańcuch boczny glutaminianu i C-końcowa grupa karboksylowa.

Odróżnienie od pokrewnych cząsteczek

• TB-500 (Ac-LKKTETQ-OH): 7 aminokwasów, C38H68N10O14, około 889 g/mol, CAS 885340-08-9.
• LKKTETQ bez grupy acetylowej: C36H66N10O13, około 847 g/mol; lżejszy o 42 Da i możliwy składnik uboczny syntezy.
• Tymozyna β4: pełne białko złożone z 43 reszt, o masie molowej około 4963 g/mol (CAS 77591-33-4); LKKTETQ zajmuje w nim pozycje od 17 do 23.
• Ac-SDKP: acetylowany tetrapeptyd z N-końca tego samego białka, C20H33N5O9, około 488 g/mol; bez wspólnego odcinka sekwencji z TB-500.
• BPC-157: 15 aminokwasów, około 1419,5 g/mol, niezmodyfikowane końce; niespokrewniony z tymozyną β4.

Na co zwracać uwagę w analityce i COA

Najpierw należy sprawdzić, jaką masę podaje certyfikat: aparaty wysokorozdzielcze mierzą masę monoizotopową, zestawienia często podają masę średnią. W widmie heptapeptydu uzyskanym metodą elektrorozpylania typowo pojawiają się:

• [M+H]⁺ przy m/z 889,50
• [M+2H]²⁺ przy m/z 445,25; dwie lizyny sprzyjają podwójnej protonacji
• addukty sodowy i potasowy przy m/z 911,48 i 927,45

Ostrożnie z pojedynczymi sygnałami: pełna tymozyna β4 pojawia się jako szereg jonów wielokrotnie naładowanych, na przykład w okolicy m/z 994 (pięciokrotnie) lub 828 (sześciokrotnie), a więc w tym samym zakresie. Miarodajna jest dopiero masa po dekonwolucji. Typowymi składnikami ubocznymi są sekwencje błędne, w których brakuje jednego aminokwasu (na przykład minus 128 Da bez jednej lizyny, minus 101 Da bez jednej treoniny), peptyd nieacetylowany (minus 42 Da) oraz zdeamidowana glutamina. Deamidacja przesuwa masę zaledwie o +0,98 Da, niemal dokładnie na pozycję pierwszego sygnału izotopowego; rozpoznać ją można pomiarem wysokorozdzielczym lub jako osobny pik w chromatogramie. Epimery, czyli cząsteczki z jednym aminokwasem w formie D, mają tę samą masę i dają się rozdzielić wyłącznie chromatograficznie.

TB-500 nie zawiera aminokwasu aromatycznego. W HPLC wykrywa się go zatem w krótkofalowym zakresie UV, w okolicy od 214 do 220 nm, na podstawie wiązań peptydowych; przy 280 nm prawie nie daje sygnału. Czystość wyrażoną w procentach powierzchni należy ponadto odróżniać od zawartości netto peptydu. Zasadowe łańcuchy boczne lizyny występują po oczyszczeniu w postaci soli, najczęściej z trifluorooctanem (TFA) lub octanem jako przeciwjonem. Przy dwóch jonach TFA na cząsteczkę na peptyd przypadałoby rachunkowo tylko około 80 % masy soli, przy dwóch jonach octanowych około 88 %, nie licząc wody resztkowej. Nie należy tego mylić: grupa acetylowa jest związana kowalencyjnie i stanowi część wzoru sumarycznego, natomiast przeciwjon octanowy jest jedynie składnikiem soli. Więcej na ten temat w poradniku Czystość peptydów badawczych.

TB-500 jest regularnie badany zewnętrznie metodami HPLC i spektrometrii mas. Dostępne certyfikaty analizy (COA) znajdują się w dziale laboratoryjnym; jeśli certyfikatu brakuje, badanie jest tam oznaczone jako oczekujące. Metody pomiarowe wyjaśnia poradnik HPLC i spektrometria mas, a odczytywanie certyfikatu – poradnik Jak prawidłowo czytać certyfikat analizy.

Przechowywanie i praca w laboratorium

Liofilizat przechowuje się w suchym, chłodnym i chronionym przed światłem miejscu, a przez dłuższy czas w temperaturze −20 °C lub niższej. Specyficznie dla tej cząsteczki: bez metioniny, cysteiny i tryptofanu brakuje klasycznych miejsc utleniania, a bez asparaginy i asparaginianu także pozycji szczególnie podatnych na deamidację i izomeryzację. Najbardziej wrażliwym miejscem jest glutamina; tworzenie piroglutaminianu, jak w przypadku N-końcowej glutaminy, nie wchodzi w grę, ponieważ znajduje się ona na C-końcu. Najważniejszym czynnikiem pozostaje wilgoć, ponieważ sole peptydów z octanem lub TFA przyciągają wodę; zimne fiolki należy więc otwierać dopiero po osiągnięciu temperatury pokojowej. W roztworze deamidacja i hydroliza przebiegają znacznie szybciej niż w stanie stałym. Więcej informacji zawiera poradnik Przechowywanie liofilizowanych peptydów.

Kontekst badawczy

W biologii strukturalnej LKKTETQ uchodzi za centralny motyw wiążący aktynę w tymozynie β4. Syntetyczny fragment pozwala badać ten odcinek w izolacji, na przykład w pracach in vitro nad oddziaływaniem z G-aktyną i organizacją cytoszkieletu, a także w przedklinicznych modelach migracji komórek. Nie wiążą się z tym żadne stwierdzenia dotyczące działania u ludzi ani zwierząt.

Wyłącznie do badań: nota prawna

GPeptides dostarcza TB-500 wyłącznie jako odczynnik laboratoryjny do badań in vitro. Nie jest on przeznaczony do stosowania na ciele ani wewnątrz ciała ludzi lub zwierząt i nie jest produktem leczniczym. GPeptides nie podaje informacji o stosowaniu ani działaniu; analityka potwierdza tożsamość i czystość odczynnika – i nic ponadto. Cenę i dostępność podają strony produktów TB-500 i BPC-157 + TB500, a dalsze fragmenty – kategoria Fragmenty peptydowe.