TB-500: struttura, analitica e manipolazione nella ricerca

Panoramica: che cosa si cela dietro il nome TB-500

TB-500 è un nome di catalogo e commerciale, non una denominazione INN né un nome sistematico. La sigla «TB» rimanda alla timosina beta 4, la proteina da cui deriva la sequenza. Il numero 500, invece, non è un dato chimico: non descrive né la lunghezza della catena né la massa. Nel catalogo la molecola compare due volte: come prodotto singolo TB-500 da 5 mg e come componente del blend BPC-157 + TB500 con una quantità pesata complessiva di 10 mg. Per l’identità non fanno fede i nomi, ma la sequenza, la formula bruta e la massa misurata riportata nel certificato.

La struttura nel dettaglio

La notazione abbreviata Ac-LKKTETQ si legge dall’estremità N-terminale a quella C-terminale. «Ac» indica un gruppo acetile (CH₃CO–), legato covalentemente al gruppo amminico del primo residuo. Seguono leucina (L), due volte lisina (K), treonina (T), acido glutammico (E), di nuovo treonina e glutammina (Q); E e Q vengono facilmente confusi.

La formula bruta è C38H68N10O14, la massa molare media circa 889,0 g/mol, la massa monoisotopica 888,49 Da. Tutti i residui sono in forma L; considerando i due stereocentri di ciascuna treonina, se ne contano nove. Il peptide è lineare, privo di ponte disolfuro e non ciclizzato.

Dal punto di vista chimico sono significative le due estremità. L’acetilazione sostituisce il gruppo amminico libero e carico positivamente con un legame ammidico neutro. L’inizio della catena somiglia così al legame peptidico presente in quel punto nella proteina ed è più difficilmente attaccabile dalle amminopeptidasi. L’estremità C-terminale non è amidata; una variante amidata sarebbe più leggera solo di circa 0,98 Da e distinguibile con sicurezza solo ad alta risoluzione. A pH neutro, alle due catene laterali protonate della lisina si contrappongono due cariche negative: la catena laterale del glutammato e il gruppo carbossilico C-terminale.

Differenze rispetto alle molecole affini

• TB-500 (Ac-LKKTETQ-OH): 7 amminoacidi, C38H68N10O14, circa 889 g/mol, CAS 885340-08-9.
• LKKTETQ senza gruppo acetile: C36H66N10O13, circa 847 g/mol; 42 Da più leggero e possibile componente secondario della sintesi.
• Timosina β4: la proteina completa con 43 residui e una massa molare di circa 4963 g/mol (CAS 77591-33-4); LKKTETQ ne costituisce le posizioni da 17 a 23.
• Ac-SDKP: tetrapeptide acetilato dall’estremità N-terminale della stessa proteina, C20H33N5O9, circa 488 g/mol; senza sovrapposizione di sequenza con TB-500.
• BPC-157: 15 amminoacidi, circa 1419,5 g/mol, estremità non modificate; non imparentato con la timosina β4.

A cosa prestare attenzione nell’analitica e nel COA

Verificare innanzitutto quale massa riporta un certificato: gli strumenti ad alta risoluzione misurano la massa monoisotopica, le tabelle riassuntive indicano spesso quella media. Nello spettro elettrospray dell’eptapeptide sono tipicamente attesi:

• [M+H]⁺ a m/z 889,50
• [M+2H]²⁺ a m/z 445,25; le due lisine favoriscono la doppia protonazione
• addotti di sodio e di potassio a m/z 911,48 e 927,45

Attenzione ai segnali isolati: la timosina β4 completa compare come serie di ioni a carica multipla, ad esempio intorno a m/z 994 (cinque cariche) o 828 (sei cariche), quindi nello stesso intervallo. Significativa è solo la massa deconvoluta. Componenti secondari tipici sono sequenze errate a cui manca un amminoacido (ad esempio meno 128 Da senza una lisina, meno 101 Da senza una treonina), il peptide non acetilato (meno 42 Da) e la glutammina deamidata. La deamidazione sposta la massa di soli +0,98 Da, quasi in coincidenza con il primo segnale isotopico; diventa riconoscibile ad alta risoluzione o come picco a sé nel cromatogramma. Gli epimeri, cioè molecole con un amminoacido in forma D, hanno la stessa massa e si separano solo cromatograficamente.

TB-500 non contiene amminoacidi aromatici. Nell’HPLC viene quindi rilevato nell’UV a lunghezza d’onda corta, tra 214 e 220 nm circa, tramite i legami peptidici; a 280 nm dà un segnale quasi nullo. La purezza in percentuale di area va inoltre distinta dal contenuto netto di peptide. Dopo la purificazione le catene laterali basiche della lisina sono presenti come sale, per lo più con trifluoroacetato (TFA) o acetato come controione. Con due ioni TFA per molecola, per calcolo solo circa l’80 % della massa del sale spetterebbe al peptide, con due ioni acetato circa l’88 %, acqua residua esclusa. Da non confondere: il gruppo acetile è legato covalentemente e fa parte della formula bruta, mentre il controione acetato è solo un componente del sale. Approfondimento nella guida Purezza dei peptidi di ricerca.

TB-500 viene analizzato regolarmente da un laboratorio esterno tramite HPLC e spettrometria di massa. I certificati di analisi (COA) disponibili si trovano nell’area laboratorio; se un certificato manca, la verifica vi risulta «in attesa». I metodi di misura sono illustrati nella guida HPLC e spettrometria di massa, la lettura di un certificato nella guida Leggere correttamente un certificato di analisi.

Conservazione e manipolazione in laboratorio

Il liofilizzato si conserva all’asciutto, al riparo dalla luce e al fresco, per periodi prolungati a −20 °C o più freddo. Specifico di questa molecola: in assenza di metionina, cisteina e triptofano mancano i classici siti di ossidazione, in assenza di asparagina e aspartato anche le posizioni particolarmente soggette a deamidazione e isomerizzazione. Il punto più sensibile è la glutammina; la formazione di piroglutammato, come avviene con la glutammina N-terminale, è esclusa, perché qui la glutammina si trova all’estremità C-terminale. Il fattore più influente resta l’umidità, poiché i sali peptidici con acetato o TFA attirano acqua; i flaconcini freddi vanno quindi aperti solo a temperatura ambiente. In soluzione deamidazione e idrolisi procedono molto più rapidamente che allo stato solido. Approfondimento nella guida Conservare i peptidi liofilizzati.

Contesto di ricerca

In biologia strutturale LKKTETQ è considerato il motivo centrale di legame all’actina della timosina β4. Il frammento sintetico consente di esaminare questo segmento isolatamente, ad esempio in lavori in vitro sull’interazione con la G-actina e sull’organizzazione del citoscheletro, nonché in modelli preclinici di migrazione cellulare. Ciò non implica alcuna affermazione su effetti sull’uomo o sull’animale.

Solo per la ricerca: avvertenza legale

GPeptides fornisce TB-500 esclusivamente come reagente di laboratorio per la ricerca in vitro. Non è destinato all’uso sul o nel corpo umano o animale e non è un medicinale. GPeptides non fornisce indicazioni sull’uso o sugli effetti; l’analitica attesta l’identità e la purezza del reagente, nient’altro. Prezzo e disponibilità sono riportati sulle pagine prodotto TB-500 e BPC-157 + TB500, altri frammenti nella categoria Frammenti peptidici.