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Pureté n’est pas synonyme de teneur. Pour comparer des COA, il faut savoir distinguer pourcentage de surface, teneur nette en peptide et sous-produits typiques de la synthèse peptidique.
Réservé à la rechercheCes trois grandeurs sont indépendantes : une pureté chromatographique élevée peut coexister avec une teneur nette modeste, sans contradiction.
En chromatographie liquide haute performance, le détecteur enregistre un signal au cours du temps ; l’appareil intègre la surface de chaque pic, puis rapporte celle du pic principal à la somme des surfaces. Deux conséquences : le chiffre dépend de la longueur d’onde choisie, puisqu’une impureté qui absorbe peu y pèse peu, et il ne compte que ce qui sort de la colonne et absorbe. La méthode est décrite dans le guide HPLC et spectrométrie de masse.
La synthèse en phase solide génère régulièrement des séquences tronquées, dites séquences de délétion, des séquences dont les groupes protecteurs subsistent et des variantes oxydées – notamment sur la méthionine ou le tryptophane. Elles apparaissent dans le chromatogramme sous forme de petits pics secondaires proches du pic principal. S’y ajoutent des formes désamidées et des dimères liés par un pont disulfure. C’est justement leur proximité avec le pic principal qui rend le gradient déterminant : trop rapide, il les fait disparaître sous le pic que l’on mesure.
Après purification, un peptide se présente sous forme de sel, souvent de trifluoroacétate ou d’acétate. Le contre-ion n’est pas une impureté au sens chromatographique, mais il influence le poids et donc la teneur nette. Sa part dépend du nombre de charges positives de la séquence et peut représenter une fraction non négligeable de la masse pesée. Pour de nombreuses applications de laboratoire, la forme saline est pertinente ; elle doit être connue.
Les peptides lyophilisés sont hygroscopiques. Un flacon ouvert à plusieurs reprises absorbe de l’eau – cela ne modifie pas la pureté, mais bien la quantité réelle de peptide par milligramme. D’où la règle : amener les flacons à température ambiante avant ouverture, ouvrir brièvement, refermer aussitôt. Les conditions de conservation sont détaillées dans le guide Stocker des peptides lyophilisés.
La teneur nette ne se lit pas sur un chromatogramme ; elle demande des mesures distinctes : analyse des acides aminés après hydrolyse, dosage de l’azote, détermination de l’eau par la méthode de Karl Fischer, quantification du contre-ion par chromatographie ionique. Ces analyses sont plus rares que la HPLC de routine et ne figurent pas sur tous les certificats. Lorsqu’un document ne mentionne qu’un pourcentage de surface, la teneur nette n’est pas documentée – ce qui ne veut pas dire qu’elle est faible.
La lecture ligne à ligne d’un certificat est reprise dans le guide Bien lire un certificat d’analyse.
Les pages produit mentionnent la pureté chromatographique mesurée par HPLC lors du dernier contrôle. Le produit analysé, la date d’analyse et la méthode figurent dans le certificat d’analyse de l’espace laboratoire ; chaque certificat nomme la marchandise à laquelle il se rapporte, et les produits sans certificat publié y sont marqués « en attente ».
Le déroulement des contrôles, de la réception à la publication, est décrit dans le guide Contrôle qualité.
Catégories associées: Fragments peptidiques · Neuropeptides
Produit analysé, méthode d’analyse, pureté en pourcentage, date d’analyse : un COA ne vaut que par les informations qu’il contient. Voici comment vérifier qu’un certificat correspond bien au produit que vous avez en main.
Lire la suite: Bien lire un certificat d’analyse (COA) →Deux méthodes, deux questions : la HPLC répond à « quelle pureté ? », la spectrométrie de masse à « est-ce la bonne molécule ? ». Ce qui se cache derrière pic, temps de rétention et m/z.
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