Tesamorelin: struttura, analitica e manipolazione nella ricerca

Panoramica e denominazione

Tesamorelin è la denominazione comune internazionale (INN) di un peptide sintetico derivato dal growth hormone-releasing hormone umano. L’ormone di partenza è chiamato anche GRF o somatoliberina. In relazione a Tesamorelin si incontrano soprattutto questi nomi:

• Tesamorelin: denominazione comune del peptide senza controione e nome di catalogo presso GPeptides; fornito liofilizzato in flaconcino con una quantità pesata di 10 mg.
• Tesamorelin acetato: forma salina con acetato come controione.
• TH9507 o TH-9507: codice di ricerca meno recente, che compare come sinonimo nelle voci delle banche dati.
• N-[(3E)-hex-3-enoyl]-hGHRH(1-44)-NH2: notazione sistematica con gruppo acilico, sequenza di partenza e ammide C-terminale.

Il suffisso INN «-relin» rimanda all’ambito degli ormoni di rilascio ipofisari, ma non dice nulla sulla famiglia recettoriale: lo porta anche Ipamorelin, pur appartenendo a un’altra classe di peptidi.

Struttura nel dettaglio

Lo scheletro è costituito da 44 L-amminoacidi esattamente nell’ordine dell’ormone umano. Tutte le modifiche si concentrano sulle due estremità della catena:

• Estremità N-terminale: il gruppo α-amminico della tirosina 1 è unito tramite un legame ammidico a un residuo trans-3-esenoile, un gruppo acilico C6 con doppio legame in configurazione E tra C3 e C4. Alla molecola manca così il gruppo amminico libero e protonabile all’inizio della catena.
• Motivo dell’acilazione: il GHRH non modificato è un substrato della proteasi dipeptidil peptidasi 4 (DPP-4), che taglia tra l’alanina 2 e l’acido aspartico 3. Il gruppo acilico è descritto come protezione da questa scissione; riguarda la stabilità enzimatica, non la sequenza.
• Estremità C-terminale: la leucina finale porta, come nell’ormone naturale, un gruppo carbossammidico neutro al posto di un gruppo carbossilico.
• Che cosa manca: Tesamorelin non contiene né D-amminoacidi né ciclizzazione, ponte disolfuro o lipidazione a catena lunga. I residui basici sono sei arginine e due lisine, quelli acidi due residui di acido aspartico e due di acido glutammico.

Distinzione dalle molecole affini

I peptidi dell’asse GH si distinguono per lunghezza della catena, tipo di modifica e recettore bersaglio:

• hGHRH(1-44)-NH2: sequenza naturale di riferimento con 44 residui, senza gruppo acilico; circa 5040 Da.
• Tesamorelin: gli stessi 44 residui più trans-3-esenoile all’estremità N-terminale; C221H366N72O67S, circa 5136 Da; recettore del GHRH.
• hGRF(1-29)-NH2: frammento accorciato ai primi 29 residui, per il resto non modificato; circa 3358 Da.
• CJC-1295 (No DAC): anch’esso 29 residui, ma con quattro sostituzioni, tra cui D-alanina in posizione 2 e leucina al posto della metionina in posizione 27; circa 3368 Da; recettore del GHRH.
• Ipamorelin: pentapeptide con unità non proteinogeniche, circa 712 Da; recettore della grelina (GHS-R1a) anziché recettore del GHRH.

Dal punto di vista analitico la massa è il criterio di distinzione più netto: tra Tesamorelin e gli analoghi a 29 residui ci sono circa 1770 Da, tra Tesamorelin e la sequenza non acilata i circa 96 Da del residuo acilico.

A cosa prestare attenzione nell’analitica e nel COA

Tesamorelin viene analizzato regolarmente da un laboratorio esterno tramite HPLC e spettrometria di massa. Nella lettura di un certificato aiutano i seguenti valori di riferimento specifici della molecola:

1. Massa attesa: circa 5135,9 Da come valore medio, 5132,7 Da monoisotopica. Con la ionizzazione elettrospray compaiono più stati di carica affiancati, secondo il calcolo (riferito alla massa media) [M+4H]4+ a m/z ≈ 1285,0, [M+5H]5+ a 1028,2 e [M+6H]6+ a 857,0. A circa 5 kDa il segnale monoisotopico non è il più intenso della distribuzione isotopica; scostamenti di 1 Da richiedono quindi una misura ad alta risoluzione.
2. Addotti: gli addotti di sodio e di potassio spostano la massa deconvoluta rispettivamente di circa +22 e +38 Da. Sono di norma un effetto della ionizzazione e non un sottoprodotto a sé.
3. Forme secondarie tipiche: il solfossido della metionina 27 (+16 Da, nel cromatogramma in fase inversa di solito con eluizione leggermente anticipata), la forma priva del gruppo acilico (−96 Da, corrispondente alla sequenza non modificata), sequenze errate derivanti dalla sintesi (ad esempio −113 Da per una leucina o isoleucina mancante, −156 Da per un’arginina mancante) e la deamidazione dell’asparagina 8 o 35 (circa +1 Da). Gli isomeri con massa identica non si notano nel semplice spettro di massa; qui è decisivo il potere di separazione dell’HPLC.
4. Controioni: dalla sintesi e dalla purificazione deriva spesso il trifluoroacetato (TFA); dopo uno scambio salino il peptide si presenta come acetato. Se tutte le otto catene laterali basiche fossero occupate, secondo il calcolo circa 480 Da sarebbero attribuibili all’acetato o circa 910 Da al TFA.
5. La purezza non è il contenuto di peptide: la purezza HPLC è la quota di area del picco principale nel cromatogramma UV e non rileva né controioni né acqua residua. Il contenuto netto di peptide si riferisce invece all’intera quantità pesata.

Per approfondire: HPLC e spettrometria di massa, Leggere correttamente un certificato di analisi e Purezza e impurità. Nell’area laboratorio si trovano i certificati di analisi (COA) disponibili; dove non ne è ancora archiviato nessuno, è indicato «in attesa».

Conservazione e manipolazione in laboratorio

Liofilizzato, Tesamorelin è nettamente più stabile che in soluzione. A breve termine bastano 2–8 °C, per periodi più lunghi è consigliabile −20 °C, sempre all’asciutto e al riparo dalla luce. Due punti della sequenza meritano particolare attenzione:

• Metionina 27: l’ossigeno dell’aria e la luce favoriscono l’ossidazione. I flaconcini vanno quindi lasciati aperti solo brevemente.
• Residui di asparagina e glutammina: umidità e calore favoriscono la deamidazione. Prima dell’apertura il flaconcino va portato a temperatura ambiente, così che sulla polvere non si depositi condensa.

I sali acetato dei peptidi sono spesso igroscopici; conviene quindi pesare rapidamente e con un’umidità dell’aria il più possibile bassa. Le soluzioni vanno preferibilmente suddivise in aliquote anziché congelate e scongelate ripetutamente. Indicazioni generali sono contenute nella guida Conservare i peptidi liofilizzati.

Contesto di ricerca

Tesamorelin è studiato nella ricerca in vitro e preclinica sul recettore del GHRH, un recettore accoppiato a proteine G di classe B che segnala attraverso la via del cAMP. Temi tipici sono il legame al recettore e la trasduzione del segnale in sistemi cellulari che esprimono il recettore, nonché il confronto tra analoghi del GHRH completi e accorciati. Per la chimica dei peptidi la molecola è inoltre un caso modello di acilazione N-terminale come protezione dalle esopeptidasi come la DPP-4.

Solo per la ricerca: avvertenza legale

GPeptides immette in commercio Tesamorelin esclusivamente come reagente di laboratorio per la ricerca in vitro. Il prodotto non è destinato all’uso sul o nel corpo umano o animale e non è offerto come medicinale. GPeptides non fornisce indicazioni sull’impiego o sugli effetti; l’analitica documenta identità e purezza del reagente, nient’altro. Prezzo e disponibilità si trovano sulla pagina prodotto Tesamorelin, i peptidi affini nella categoria Peptidi GHRH & GHRP.